植酸酶是近年来开发和应用的一类环保型微生物饲料添加剂。目前尚未完全解决植酸酶在制粒的过程中暴露在70℃～90℃的高温下失活和在消化道中保持高活性的问题。近来研究用基因工程、抗蛋白酶降解、改变最适pH值等的方法提高植酸酶的热稳定性。本文简要综述了近年来植酸酶的分子改造以及转基因方面的几种技术研究进展。
1 植酸酶分子的糖基化修饰
     质的糖基化修饰有助于提高植酸酶的热稳定性。Han等(1999)把A.niger phyA基因在P.pastoris中表达重组phyA的分子质量变为95ku，比A.niger天然表达的phyA的分子质量(80ku)大19%，在糖基化水平上略有提高，最适温度变为60℃，比原酶的最适温度提高2℃。通过一定的方法去糖基化后，酶分子质量减为55ku，同时热稳定性也降低34%。设计新的表达载体使phyA基因在Saccharomyces cerevisiae中表达，由于S.cerevisia表达系统的高度糖基化作用，重组酶的分子质量达到120ku，比A.niger天然表达的phyA的分子量大50%。重组酶的最适酶促反应温度55℃~60℃，比原酶的范围更宽；未完全纯化的重组酶在55℃与80℃下分别作用15min之后，酶活分别保留95%和75%，而同样条件作用后的商品酶PhyA酶活保留分别为72%和51%。该重组phyA经去糖基化后，酶活只降低了9%，但酶的热稳定性大为降低，80℃加热15min,酶活损失40%。去糖基化后的分子质量变为50ku，与由其他宿主系统表达的基因相同但耐热性差的rphyA的分子质量相似。充分说明了糖基化程度对该酶热稳定性有重要影响。
2 植酸酶的定点突变
    对phyA的基因工程改造已经基本成熟。Tomschy等(2000)通过比较分别来自A.niger菌株NRRL3135和T213中不同活性的两个植酸酶，发现12个不同的氨基酸中第297号残基Arg突变为Gln的定点突变导致了植酸酶与底物结合能力下降，从而引起了活性的降低。Tomschy等(2002)对A.fumigatus中与最适pH相关的多个极性氨基酸残基(Gln27、Ser140Asp141、Gly277、Tyr282)进行了研究，初步确定了其在pH和活性方面的作用。Mullaney等(2002)将来源于A.niger的phyA进行Glu300Lys点突变，获得了pH4.0和37℃下活性提高了56%的植酸酶。彭日荷等(2002)以烟曲霉中耐高温植酸酶基因phyA为基础，通过定点突变将部分密码子替换成毕赤酵母的偏爱密码，得到的重组子经过高密度发酵，其表达量比原始基因提高13倍并有很好的耐热性。谷维娜等(2007)对A.fumgatus来源植酸酶的Q23L和Q23L、G272E进行突变研究，结果发现突变酶Q23L在pH5.5的比活性由51U/mg提高到109U/mg，突变酶Q23LG272E在pH3.0～4.5和pH6.5～7.0时的稳定性比Q23L有所提高。
    近年来，对细菌植酸酶的改造也有了系统的研究，现在对细菌植酸酶的改造大多针对E.coli的appA。Rodriguez等(2000)将appA和其三个多位点突变的突变体在Pichia pastoris表达，发现突变体Cys200Asn/Asp207Asn/Ser211Asn虽然糖基化没有增强，但其植酸酶活性在多个方面得到了提高。
3 植酸酶的同序概念
    同序概念是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列，人工合成同序列基因后重组表达。Lehmann等(2000)把同序概念这种方法应用在真菌植酸酶家族含13种不同子囊菌类的序列，进行同序比较计算，设计合成了同序植酸酶基因fcp，构建表达载体pFP，在H.polymorpha中表达出同序植酸酶-1。同序植酸酶-1的最适温度为71℃，而亲代植酸酶的最适温度为45℃～55℃，增加了16℃～26℃，同序植酸酶-1Tm为78℃，比亲代植酸酶增加了15℃～22℃，而催化性质与大多数亲本植酸酶相似。经定点突变发现在同序植酸酶-1中有5个氨基酸Y31、P225、M342、F346、Y372，表现增加同序植酸酶的热稳定性，两种残基F296、A384不稳定。
    Lehmann等(2002)在上述研究的基础上，通过增加更多的真菌植酸酶序列到组合中去。这些组合用于计算出两种同序植酸酶氨基酸序列，即同序植酸酶-10和同序植酸酶-11。同序植酸酶-10比同序植酸酶-1Tm和最适温度分别表现7.4℃和9.0℃增加。通过定点突变检测，8个位点氨基酸残基的替换(E35A、D174N、E244D、R268I、R306H、S341T、A356K、G381A)，和11个位点氨基酸残基的替换(E35A、D46K、D174N、T191L、E199T、E244D、R268I、R306H、S341T、A356K、G381A)可增加植酸酶的热稳定性，将这些突变分别增加到同序植酸酶-1中，产生同序植酸酶-1-thereto(8)和同序植酸酶-1-thermo(11)。同序植酸酶-1-thereto(8)Q27T和同序植酸酶-1-thereto(11)Q27T比同序植酸酶-1Tm增加6.7℃和10.5℃。Q27T突变对植酸酶的热稳定性几乎没有影响。
4 杂合植酸酶
    用杂合酶的方法可将同源植酸酶的相同部位的二级结构单元进行交换，产生杂合植酸酶，提高植酸酶的热稳定性。Jermutus等(2001)根据A.niger植酸梅酶晶体结构，在A.tereus植酸酶的表面α螺旋(66～82区域)被相应A.niger植酸酶置换，导致杂合酶蛋白A(phyA)热稳定性改善，与A.niger相似，而酶活性未变。其原因在于两个不同来源的植酸酶在分子表面α螺旋中氨基酸改变S58Y、T70L、A78V导致疏水相互作用，增加热稳定性。同源蛋白稳定性的不同是由于许多在进化中分散在整个序列中单点突变引起的。通过用更稳定或较不稳定相互作用的同源片段改变具很小稳定性或更多不稳定的相互作用的元素能引起稳定性的改善。
5 结构延伸突变
    结构延伸突变是在蛋白质的C端上连接一段随机肽段，从而改变蛋白质的结构,达到改善酶性质的目的。吴琦等(2004)在植酸酶C端增加了来源于表达载体序列的13个氨基酸残基，使融合表达植酸酶其最适反应温度高达75℃，比出发菌株植酸酶的高15℃，比非融合表达植酸酶的高25℃；其耐热性也显著提高90℃处理10min后的残留酶活性为37℃时的75.7%。陈惠等(2005)将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA，将重组表达载体在GS115酵母中表达纯化的突变酶与野生型酶相比，最适反应温度上升了3℃，75℃处理10 min，热稳定性提高21%，比活力略有提高；最适反应pH值为5.6，有效pH值为4.6～6.6，比未突变酶扩大了0.4个单位。
6 植酸酶的定向进化
     定向进化是在试管中模拟达尔文进化过程，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的酶，实现分子水平的模拟进化。这是目前改善酶性能最有前途的方法。该方法是在不需事先了解酶的空间结构和催化机制的条件下，通过各种突变方法向编码酶的基因中引入突变，突变的基因可以通过DNA改组等方法进行重新组装，提高基因进化的效率，获得一些性能改变的突变酶。胡光星(2002)对来自黑曲霉(A.nigr)的植酸酶基因经过四轮改组后筛选到酶活性比原始植酸酶提高12倍的改组基因，克隆到毕赤酵母后在50L发酵罐上高密度发酵，酶活单位由原来的6.8×104IU/mL提高到80×105IU/mL。魏威等(2004)通过随机突变的方法，对来源于A.niger的植酸酶基因phyA进行了改造，将其导人大肠杆菌BL21(DE3)中，构建工程菌株BL21-PET21a(+)-phyA。结果植酸酶基因在工程菌株中得到了高效表达，表达量达到菌体蛋白的30%以上，生物活性达到1500U/mg，并且复性蛋白质具有较好的热稳定性；经过75℃～95℃，30min的热处理后，仍然保持了生物活性，同时有明显的热激活现象，热激活后最高生物活性达到5000U/mg。Garrett等(2004)从植酸酶appA的19个氨基酸残基中32个可能与耐热相关的密码子中筛选耐热突变体。获得了在62℃下1h有完全酶活，而在85℃下10min仍有27%的活性的耐热菌株，并且在胃中的稳定性也提高3.5倍。