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技术文献
高效组合型木聚糖酶的原理与应用
木聚糖等非淀粉多糖的抗营养机制,主要在于其本身难于被单胃动物所消化和吸收,增加了消化道内食糜的粘稠度和微生物数量,阻碍了营养物质,尤其是蛋白质和脂肪的吸收,降低了饲料的营养价值和表观消化能,并与生物活性物质相结合,从而抑制内源消化酶的消化能力;而且,日粮中过多的木聚糖影响了动物消化系统的健康,引起消化器官代偿性增生和消化酶补偿性分泌水平的升高(Marquardt, 1996)。

添加木聚糖酶可以破坏植物的细胞壁结构,缓解或消除木聚糖的抗营养作用,主要表现在:改善料重比和饲料转化率(Broz and Perrin-Voltz,1994;Omogbenigun et al.,2004),降低胃肠道食糜粘度,减少肠道疾病的发生,增进畜禽健康,提高育成率和蛋鸡生产率(Mohan et al.,2001),增加真代谢能(TMEn)(Flores et al.,1994),改善消化酶代偿性分泌问题(Brenes et al.,1993;王金全等,2005),减少污染物的排放并节约成本(Munaro et al.,1996;Omogbenigun et al.,2004)。

木聚糖酶可以来源于微生物(Bastawde,1992;Maurelli et al., 2008)、植物和共生微生物(Gupta et al.,2009;Singh et al.,2009),其分子量为5500~60000Da。不同来源的酶具有不同的分子特点,比如分子量和氨基酸序列及其组成,不同的最适pH和温度,等电点和碳水化合物含量(Bastade,1992;Khucharoenphaisan et al.,2008;Pollet et al.,2009);不同的木聚糖酶还具有不同的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)(陈冠军等,2004;曾艳等,2004;赵新河等,2009)。但是,木聚糖酶作为一个酶系,单一组分的米氏常数并不能完全反应酶整体对于底物的亲和力,因此,测定全酶系米氏常数的方法,能够更全面反映木聚糖酶的作用效率(Klyosov, 1990)。此外,不同来源的酶有不同的结合位点,如Meagher et al.(1988) 指出黑曲霉产生的内切性木聚糖酶有8个结合位点,Vrsanská et al.(1982)发现黑曲霉来源的酸性木聚糖酶有7个亚位点,而隐球菌来源的内切性木聚糖酶底物结合位点是由4个亚位点所组成的(Biely et al.,1981)。

基于以下八个方面,组合酶的理论得以被提出(冯定远,2004):(1)催化降解同一底物的酶来源很多,它们之间的催化功能既有可替代的、也有不可替代的。这样,可替代性就有更多的选择性,对整体降低应用成本有好处;不可替代性就存在着互补性,对真正发挥酶的最大效率有好处。例如,木聚糖酶有植物和微生物的,包括20余种细菌菌株、16种真菌、3种酵母以及8种放线菌中分离出相应的木聚糖酶(Beg et al.,2001)。饲料工业中应用的木聚糖酶主要来源于米曲霉、黑曲霉和酵母菌等真菌,也有小部分来源于芽孢杆菌等细菌。(2)不同来源酶的酶学性质是不同的,它们催化降解的位点不同,有些是外切酶,有些是内切酶。有目的互补组合,能够发挥各自性能,配合而达到最佳的作用效果。例如,木聚糖酶对多聚木聚糖的内部β-1,4键有活性,这种木聚糖酶称为内切木聚糖酶。根据其对不同多糖的活性,内切木聚糖酶又可分为特异性和非特异性木聚糖酶(Coughlan,1992;Coughlan et al.,1993)。特异性内切木聚糖酶仅对木聚糖的β-1,4键有活性,而非特异性内切木聚糖酶可以水解以β-1,4键连接的木聚糖、混合木聚糖的β-1,4键及其他β-1,4连接的多糖,如CM-纤维素。(3)如果饲料成分复杂,底物特别是非淀粉多糖的降解需要多种酶之间协同作用。二个或更多的酶之间的有效配合,其作用效果好于单一添加任何一种酶制剂的叠加作用,这种现象就是协同作用。Giligan and Reese(1954)在水解纤维素的过程中,首次证实了不同纤维素酶间的协同增效作用。类似的几项研究验证了在晶体纤维素的溶解过程中,内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶之间的协同作用(Wood,1988;Klyosov,1990;Bhat,1994)。(4)在一定条件下(特定的作用环境和时间),某一种酶数量或活性进一步增加并不能提高催化性能,各种酶和对应的底物浓度的反应基本动力学是米氏方程(陈石根和周润琦,2001),而不同来源作用同一种底物的酶的米氏方程不一样(陈芳艳,2010)。(5)同一类酶而来源不同的其最适条件差异很大。于旭华(2004)对7种不同来源木聚糖酶进行比较发现,来源于曲霉、木霉及酵母等真菌的木聚糖酶最适pH在4.5~5.5之间,而以枯草杆菌为代表的细菌性木聚糖酶的最适pH值为5.5~7.0之间,即细菌性木聚糖酶具有比真菌性木聚糖酶更高的最适pH,在偏中性环境条件下具有很高的酶活表现。(6)同一类酶而来源不同的热稳定性差异很大。例如:于旭华(2004)将5种木聚糖酶的含水量调至16%后,然后在75℃,85℃和95℃的温度条件下分别处理5min、10min,结果发现,在75℃条件下分别处理5min和10min后对5种木聚糖酶的酶活影响很小,各种酶活均保持在对照组酶活的85%以上,在85℃条件下分别处理5min和10min后,各种木聚糖酶的酶活均保持在对照组酶活的85%以上,95℃条件下分别处理5min后,各种木聚糖酶的酶活保持在80%以上,而95℃条件下分别处理10min后,除细菌性木聚糖酶6#的活性还保持对照组的93.43%外,真菌性木聚糖酶1#、2#、3#和细菌性木聚糖酶4#的酶活分别降为对照组酶活的84.78%、78.32%、70.00%和73.11%。(7)同一类酶而来源不同对于胃肠道的蛋白水解酶的耐受性差异很大。于旭华(2004)发现,真菌性木聚糖酶和细菌性木聚糖酶在反应体系中胃蛋白酶的浓度为200U/mL的条件下反应15min、30min和60min后,真菌性木聚糖酶活性分别降为原来的28.09%、15.36%和6.87%,细菌性木聚糖酶活性分别降为原来的28.09%、15.36%和6.87%(8)同一类酶而来源不同饲料的一些离子对酶的活性影响差异很大。于旭华(2004)对6种不同来源的木聚糖酶的研究发现,各种金属离子单独在木聚糖酶溶液中添加对真菌性木聚糖酶3#的影响较大,各种金属离子均抑制了真菌性木聚糖酶3#的酶活,各种金属离子对其它2种真菌性木聚糖酶和3种细菌性木聚糖酶的活性影响不大;其中,Cu2+、Fe2+、Mn2+和Zn2+共同存在于木聚糖酶溶液中则降低了各种来源木聚糖酶的活性,真菌性木聚糖酶1#、2#、3#和细菌性木聚糖酶4#、5#和6#的木聚糖酶活性分别降为对照组活性的54.56%、77.00%、27.30%、38.89%、46.02%和37.69%。

饲料组合酶设计及其应用的价值和意义在于:(1)催化同一底物而来源不同的酶的价格是不同的,互相组合,可以利用一些来源方便,商业生产成本比较低的酶制剂,再结合一些相对成本高、而作用能够互补的酶制剂,在保证酶添加使用效果的情况下,整体降低饲料酶制剂添加剂的使用成本,有利于酶制剂添加剂推广使用。(2)饲料生产成本的问题,相当程度是由于原料成本上涨造成的,开发和有效利用非常规饲料原料是关键。非常规饲料原料主要由于含有一些抗营养因子,影响了它们的高效利用。目前处理非常规饲料原料往往使用一些专门的酶制剂,但是由于一些非常规饲料原料成分和结构的复杂性,一般的单酶或者复合酶并不能有效的解决其利用效率的问题。组合酶或组合型复合酶由于其酶种来源及其互补和协同特性,在理论上具有比一般单酶或复合酶的酶学特性的优势,能够发挥其快速高效作用的潜能。因此,组合酶或组合型复合酶在提高非常规饲料原料日粮的利用效率、有效地开发非常规饲料原料资源等方面具有巨大的潜力。(3)一些畜禽种类和生长阶段,由于消化生理特性的关系,不能很好地利用人工配制的日粮,特别是日粮中含有较多的植物性成分以及难于利用的成分,使一些饲料产品的质量低且不稳定。应用组合酶或组合型复合酶互补性和协同特性,有针对性开发特种动物专用或特种类型日粮专用的组合酶或组合型复合酶,组合酶或组合型复合酶有可能为部分或全部解决这些问题提供了一种有效措施。
综上所述,组合酶理论的提出,为开发新型高效复合型酶制剂产品奠定了坚实的理论基础。