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饲料营养价值体外评定方法研究进展
对各种饲料的生物学效价进行准确评定是建立营养需要量标准、优化饲料配方的基础性科学决策依据。目前,评定饲料生物学效价的方法主要有化学分析法、体内法和体外法。化学分析法是指由Weende试验站的Henneberg与Stohmann首倡的概略养分测定方法,是评定饲料营养价值的一种常用方法,但利用概略养分分析所得的饲料养分与动物消化吸收养分之间存在很大差异,不足以准确地反映饲料的实际营养价值。动物试验能够比较准确地对饲料营养价值进行评定,但这些方法往往耗时、费力,很难在短时间内对大量的饲料样品进行分析评价,且生物学影响因素多,结果变异大,重复性差,限制了其实用性。随着动物消化生理研究的深入和技术手段的创新,利用动物体外消化模拟技术来研究饲料的营养价值也成为可能。为此,人们建立了体外法来研究饲料的营养价值。体外法具有简单、快捷、重复性好等特点,在饲料营养价值评定等方面占有重要地位。本文以猪为例对体外仿生法技术的发展历程、存在问题及前景进行一些浅显的讨论,以飨读者。
    由于猪是杂食动物,个体较大,体外消化法所需要的一些消化酶(如胃蛋白酶和胰酶)以及小肠液等比较容易获得,而且一次性获得量也比较大,其难度应是介于反刍动物与禽类之间的复杂问题。因此,体外消化法在猪上的研究和应用较多。
    体外消化法方面的研究历史可分为单酶(如胃蛋白酶)法、两步法(胃蛋白酶-胰酶法)、三步法(胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶法)及电脑仿生程控三步消化法等,大致是从早期的简单模拟胃酶消化过程到中期的模拟胃、肠道多步消化法,最后向近期的全消化道仿生酶谱的建立到电脑仿生程控的方向发展。
    胃部的主要消化酶是胃蛋白酶,其他酶的含量较低,一般被忽略不计。用胃蛋白酶水解法评定饲料或食物的可消化性,虽然只能反映在规范水解条件下对某一饲料或食物中的蛋白质生物学效价的一个片面评价,但该法便捷、重复性好、具有可比性,并且药用胃蛋白酶产品早已标准化,因此作为一种相对参比值被广泛接受。
    鉴于用单一胃酶法评定饲料生物学效价的局限性。20世纪70年代,许多学者在胃蛋白酶的基础上加上胰液、猪小肠液以及商品复合酶等用于饲料生物学效价评定。张子仪等在前人工作的基础上,系统比较不同猪品种、饲喂不同类型日粮、不同瘘术部位采集的小肠液酶活效价等之间的相关关系,总结出了以胃蛋白酶和猪小肠液冻干粉水溶液处理为主要手段的体外消化试验方案。同一时期,Dierick曾提出用胃蛋白酶制剂与胰酶制剂水解处理为标志的体外两步法。在测定猪的能量消化率及蛋白质、氨基酸利用率方面也取得了令人满意的结果,但都限于所用酶制剂的标准化问题、以及试剂盒开发中的技术规范问题是否能达到肠道全程仿生效果,尚待进一步研究。
    20世纪90年代加拿大学者Regmi等以三角瓶为反应器,用胃蛋白酶 - 胰酶 -碳水化合物酶法,及水杨酸处理为主线的模拟胃肠水解环境及水解产物分离为目标的体外法,提出了预测生长猪对大麦样本全消化道能量表观消化率的回归模型 (y=1.23x-25.33 ;R2=0.97。
    在诸多的国内外研究者公开报道的酶消化体系的in vitro 测试手段方面,基本上停留在以三角瓶、透析管、摇床等为组件的手工操作阶段,人为设定酶谱条件下获得的信息。从仿生的角度及从所获参数的可比性与可重复性等方面都具有很大的局限性。为此,从20世纪后期开始,有学者就仿生酶谱的设计依据,消化过程中水解环境、消化液的加入、乃至水解产物的分离,饲料样品的制备、仿生酶消化系统、透析膜的筛选、饲料样本量与消化酶的配套用量、缓冲液的配制(离子浓度、缓冲体系、pH等)、反应温度、消化时长等因素的标准化与规范等方面的立论依据开展了研究,在此基础上开发了第一代到第三代“单胃动物仿生消化系统”。从仿生消化法研究的历程分析,其初衷都是以便捷为前提,为获取趋近于可信的生物学法信息为目标,以精度、重演性好为约束条件。上述单一胃消化法与胃肠酶消化多步法的设计原则基本上如出一辙。各家在选定的消化酶或商品消化酶产品的功能分析方面都难免有以点代面,以面代全之嫌,在实际操作中又存在着酶谱设计、酶活力乃至酶与酶、外源酶与内源酶之间互补颉顽,以及手工操作中不可回避的种种未知因素的干扰。单胃动物仿生消化系统在模拟全消化道酶水解体系的仿生学方面将沿用一个多世纪的各种方案互通有无,取长补短。
    动物体内的消化过程是复杂的、高度精密和完整的体系,是通过神经和激素调控对各种刺激发生反应的动态过程。在动物体外准确模拟体内消化系统复杂的消化吸收过程非常困难,甚至是不可能的,主要原因是许多体内发生的化学反应或物理过程在体外是无法模拟的,如日粮纤维对于食糜通过消化道速率的影响;抗营养因子对体内养分消化和吸收过程的影响;蛋白质和氨基酸内源损失对蛋白质和氨基酸表观消化率的影响,对于消化道内微生物之间复杂的互作关系更无法在体外试验中模拟。
    综上所述可知,体外消化测定法在实际应用中存在许多局限性,但这并不意味着对于体外法的研究没有意义,相反体外消化测定技术在评定饲料价值方面具有很大的潜力。
    体外消化测定技术经过几十年的研究已有了很大发展,体外消化测定技术的几个发展方向是:由简单向复杂、由单酶向多酶、由密闭静态孵育体系向动态透析孵育体系、由动物消化液(小肠液和瘤胃液)向商品酶制剂(胃蛋白酶制剂、胰酶制剂和微生物纤维降解酶),从只能估测干物质和蛋白质营养价值到还能估测钙、磷、粗纤维等物质的营养价值发展的趋势。是一种极具潜力的饲料营养价值评定方法,能较好地对饲料消化性的优劣进行比较,并通过消化率差值法研究日粮粗蛋白质摄入量对内源氨基酸排泄量的相对影响,其不断发展的目的是为了能更简便、快速、准确地估测体内消化率,从而更科学地评定饲料营养价值。